Proteína

Ilustración que muestra un andamio de ADN que sostiene dos proteínas juntas durante la espectroscopia de fuerza acústica [Vladimir Kunetki]

Los enlaces temporales proteína-proteína son esenciales para procesos que incluyen reacciones enzimáticas, unión de anticuerpos y respuesta a medicamentos. Ser capaz de caracterizar con precisión estos enlaces es importante para probar el rendimiento de posibles terapias, pero los métodos disponibles actualmente para hacerlo tienen una capacidad limitada para proporcionar información a nivel de enlace único o para probar un gran número de enlaces.

Investigadores del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) y sus colegas ahora han presentado un método más accesible para medir la fuerza y ​​la duración de los enlaces proteína-proteína bajo cargas similares a las que experimentarían dentro de nuestros cuerpos. El método utiliza ondas de sonido para separar las proteínas unidas y correas de ADN para mantener las dos proteínas juntas para que puedan volver a unirse después de que se rompa su conexión. Esta innovación permite que los mismos enlaces de proteínas se vuelvan a probar hasta 100 veces, lo que proporciona información valiosa sobre cómo cambia la fuerza de los enlaces a medida que las moléculas envejecen. Esta capacidad podría proporcionar nueva información sobre la vida media de fármacos o anticuerpos.

Al informar sobre su trabajo en Biophysical Journal ("Combinación de andamios de ADN y espectroscopia de fuerza acústica para caracterizar enlaces de proteínas individuales"), el autor principal Laurent Limozin, PhD, biofísico del CNRS y colegas, declaró: "Esta prueba de principio se establece para dos enlaces proteicos de interés biomédico, que abren perspectivas prometedoras para los estudios biotecnológicos y médicos".

Las propiedades de unión de las biomoléculas, que gobiernan los fenómenos biológicos, son relevantes para evaluar la terapia, explicó el equipo, pero se necesitan nuevas herramientas experimentales para caracterizar, de manera multiplexada, la ruptura de enlaces proteicos bajo la fuerza. "Si bien las mediciones masivas realizadas en poblaciones de moléculas siguen siendo las técnicas de caracterización estándar, la espectroscopia de fuerza de molécula única (SMFS) en pares individuales de socios que interactúan se ha convertido en una poderosa estrategia complementaria porque brinda acceso único a la respuesta de enlace individual a la fuerza".

Para su estudio recientemente informado, Limozin y sus colegas combinaron, por primera vez, afirmaron, andamios de ADN con espectroscopia de fuerza acústica (AFS) para medir la respuesta de fuerza de complejos biomoleculares individuales. La espectroscopia de fuerza acústica permite probar muchos pares moleculares simultáneamente, y los andamios de ADN permitieron probar repetidamente los mismos enlaces.

"Queríamos proponer un método que sea lo suficientemente modular para aplicarlo a diferentes tipos de enlaces, que tenga un rendimiento razonable y que alcance una alta precisión molecular que actualmente solo está disponible con técnicas muy refinadas, como pinzas ópticas o magnéticas, que a menudo son difíciles de entender para los no especialistas", dijo Limozin.

Durante la espectroscopia de fuerza acústica, se analizan pares de proteínas unidas dentro de una cámara llena de líquido. Las proteínas están restringidas por un andamiaje de ADN, de modo que una hebra de ADN une la primera proteína al fondo de la cámara, mientras que otra hebra une la segunda proteína a una pequeña perla de sílice. Cuando los investigadores hacen estallar la cámara con una onda de sonido, la fuerza de la onda tira de la perla de silicio, y la proteína a la que está unida, lejos del fondo de la cámara. Si la fuerza es lo suficientemente fuerte, esta acción de tracción rompe el vínculo entre las dos proteínas.

Para el nuevo método, una tercera hebra de ADN actúa como una correa para mantener las proteínas juntas después de que se rompa su enlace. "... presentamos la combinación de un andamio de ADN modular, a saber, ADN unido (J-DNA), con AFS, un método paralelo emergente que potencialmente ofrece un amplio rango dinámico de aplicación de fuerza rápida", escribieron los científicos. "El complejo proteico sondeado se une tanto a la superficie de la celda de flujo como a una perla a través de vástagos de ADN de un par de kilobases conectados por la correa".

"La originalidad de nuestro método es que, además de estos dos hilos en cada lado, en el medio tienes esta correa que conecta los dos hilos y mantiene las proteínas juntas en caso de ruptura", explicó Limozin. “Sin esta correa, el desprendimiento sería irreversible, pero esto te permite repetir la medición casi tantas veces como quieras”.

Como prueba de concepto, el equipo de investigación utilizó la técnica para caracterizar dos interacciones de una sola molécula de interés biomédico: el vínculo entre las proteínas y la rapamicina, un fármaco inmunosupresor, y el vínculo entre un anticuerpo de un solo dominio y un antígeno del VIH-1. "Además de su interés para la evaluación comparativa, la rapamicina tiene una importante relevancia biomédica, ya que es uno de los primeros moduladores de la interacción proteína-proteína en llegar a la clínica", comentaron los investigadores. Los investigadores observaron los ciclos de unión y ruptura usando un microscopio. También compararon sus resultados con los de técnicas bien establecidas, como pinzas magnéticas, para garantizar su precisión.

Ser capaz de probar el mismo enlace proteína-proteína varias veces es importante para explorar la variación entre pares molecularmente idénticos. También permite a los investigadores examinar cómo cambian estas interacciones a medida que las moléculas envejecen, lo que podría ser importante para determinar la vida media de fármacos o anticuerpos. "... combinar AFS y J-DNA tiene el potencial de responder preguntas fundamentales y abrir el camino a la caracterización quimiomecánica sistemática de interacciones biomédicamente relevantes", señalaron.

"Con esta herramienta, tenemos una manera de profundizar y realmente probar ideas experimentales sobre la heterogeneidad molecular y el envejecimiento molecular", dijo Limozin. "Nosotros, y otros, sospechamos que la caracterización de estas propiedades será muy útil para diseñar terapias futuras que deberán funcionar en situaciones en las que intervienen fuerzas mecánicas".

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